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Datenanalyse

MS-Datenanalyse


MALDI-Massenfingerprint eines SYPRO®-Ruby gefärbten 2D-Gel-Spots.
Instrument: UltraflexTMTOF-MALDI-MS (Bruker Daltonics, Bremen).
Probenpräparation: GyrolabTM MALDI SP1 von Gyros AB (Uppsala, Schweden).
(Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Irrgang, Max-Volmer-Institut, Technische Universität Berlin)


Die hohe Empfindlichkeit, Massengenauigkeit und Auflösung, die moderne Massenspektrometer erreichen, verlagert die Notwendigkeit weiterer Verbesserungen auf den Bereich der Probenpräparation.

Proteinidentifizierung mittels Massen-Spektrometrie erfordert bei den meisten Proteinen die Zerlegung der Proteinsequenz in kleinere Abschnitte durch den Einsatz proteolytischer Enzyme. Die resultierenden Peptidfragmente müssen gelöst und entweder auf ein MALDI-Target oder in eine ESI-MS-Kapillare überführt werden. Der quantitative Transfer der Proben aus einer Polyacrylamidgelmatrix und der Transfer in das zur Analyse bereitstehende Massenspektrometer - idealerweise aller resultierender Peptidfragmente, ist eine Herausforderung, die meist nur teilweise experimentell realisiert wird.

Zur erfolgreichen Ionisation in Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation-Spektrometern müssen die Peptide auf oder in der Nähe der oberen Grenzfläche einer kristallinen Matrixsubstanz plaziert werden. Experimentelle Einflussgrößen wie (1) die chemische Natur der Matrix, (2) die Hydrophobizität des Matrix-Lösungsmittels, (3) die Hydrophobizität des die Peptide enthaltenden Lösungsmittels, (4) das Verhältnis von Probe zu Matrix, (5) die Menge an Verunreinigungen und (6) die Ankergeometrie und Beschichtung, bestimmen analytisch wichtige Größen wie die Abmessungen der sich bildenden Kristalle, die Menge und die Anzahl der Peptide auf dem Target, sowie die Lage und den Grad der Verteilung der Kristalle innerhalb der heterogenen Anordnung einer MALDI-Target-Präparation.
Während gut optimierte Parameter es erlauben in vollem Umfang von der in der Regel hohen Geräte-Performance Gebrauch zu machen, können schlecht optimierte Präparationsbedingungen zum völligen Ausfall führen, unabhängig davon wie überragend die Eigenschaften des analysierenden Massenspektrometers auch sein mögen.
Bei sauren Peptidmischungen, die in wässrigen oder zumindest überwiegend wässrigen Medien gelöst sind, können mit Hilfe der GyrolabTM Probenvorbereitungsmethode MALDI-Targetpräparationen erhalten werden, die in höherem Maße standardisiert und somit besser reproduzierbar sind. Mit dieser Methodik können MALDI-MS-Fingerprint-Spektren aus <100 nL Probe erhalten werden, eine nicht übermäßige posttranslationale Modifizierung der Gentranskripte und ein sequenziertes Genom vorausgesetzt. Auf diese Weise können Proteinidentifizierungen aus 2D-Gel-Spots mit <300 amol Proteingehalt gelingen. MALDI-MS-Fingerprinting kann mit einem Durchsatz von >100 Proben pro Instrument und Tag durchgeführt werden.

Elektro-Spray-Ionisations-Massenspektrometrie hat Ihr spezielles Anwendungsgebiet wenn der Schwerpunkt weniger auf absoluter Empfindlichkeit und Durchsatz, sondern mehr auf der Gewinnung einer De-Novo-Sequenzinformation liegt. Nano-Liquid-Chromatography-ESI-MS kann eine Empfindlichkeit von ~20 fmol Protein pro 2D-Gel-Spot erreichen, jedoch ist die Wahrscheinlichkeit Sequenzen nützlicher Länge zu erhalten wesentlich besser, wenn mehr Material zur Verfügung gestellt werden kann.
Wie auch bei der MALDI-MS bestimmen experimentelle Faktoren wie (1) Art der benutzten Kapillaren oder LC-Kopplung, (2) die Hydrophobizität der die Peptide enthaltenden Lösungsmittel, (3) die Menge an Verunreinigungen und zu einem großen Anteil (4) die Erfahrung des Experimentators die analytisch wichtigen Einflussgrößen wie die Stabilität des Sprays und wie leicht die Auswahl interessanter Peptide für die MS/MS-Analyse fällt. Da der Gehalt an verunreinigenden Peptiden und Salzen nur schwer für alle Spots eines 2D-Gels standardisiert werden kann, da sowohl der Proteingehalt der Spots stark variieren kann, ebenso wie die Hydrophobizitätseigenschaften der Proteine und ihrer proteolytischen Fragmente und ferner bei schächeren Spots häufig schwer zu standardisierende zusätzliche Konzentrierungs- und Entsalzungsschritte notwendig werden, müssen Parameter wie die Kapillarenposition oder die Cone-Spannung an die individuelle Probe angepasst werden, um gleichmäßig gute Sprays für alle Proben zu erhalten. Die aufgrund der variierenden Probeneigenschaften notwendigen wiederholten korrigierenden Eingriffe des Experimentators können im Extremfall den potentiell hohen Durchsatz dieser Methode (für einheitliche Proben) auf bis zu lediglich 1-2 Proben pro Instrument und Tag verringern.




SYPRO® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Molecular Probes Inc., Eugene (USA)
UltraflexTMist ein Warenzeichen von Bruker Daltonics Inc., Billerica (USA)
GyrolabTM ist ein Warenzeichen von Gyros AB, Uppsala (Schweden)