Proteinidentifizierung - Technische Details
Probenvorbereitung
Proteinidentifizierungen mit MALDI-Peptide-Mass-Fingerprinting können für alle gebräuchlichen MS-kompatiblen Färbemethoden (Cy-Dyes, Sypro-Ruby® oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, MS-kompatible Silberfärbungen, Coomassie G250 und R250-Färbungen) angeboten werden. Die Proteinidentifizierung kann auch aus getrockneten Gelen vorgenommen werden, jedoch ergeben Proben aus nicht getrockneten Gelen bessere Identifizierungsraten.
2D-gel Proben silbergefärbt (links), Coomassie G250 (Mitte) und Coomassie R250 (rechts). PCE-MM200 Digital USB Microscope (200x).
(Mit freundlicher Genehmigung der WITA GmbH, Teltow, Germany)
Bitte beachten Sie:
Generell: Vermeiden Sie die Exposition Ihrer Proben gegen proteinmodifizierende Bedingungen. Gerne beraten wir Sie vor Projektbeginn zu projektspezifischen Problemen der Probenvorbereitung für das MALDI-Peptide-Mass-Fingerprinting. Insbesondere gilt: 1D SDS-PAGE-Proben: Bitte nicht erhitzen. Die übliche Praxis 1D-Proben auf 95°C oder mehr zu erhitzen erschwert die Identifzierung der Proteine mit MALDI-Peptide-Mass-Fingerprinting.
2D-Gel-Proben: Bitte nicht erhitzen. Verwenden Sie hochreinen Harnstoff. Vermeiden Sie Thioharnstoff.
Tryptischer Verdau
Der Verdau erfolgt mit Sequence-Grade-Modified-Trypsin (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg) gemäß Proteome Consults C18-freiem Protokoll.
Target Präparation
Verdaulösung und Extrakte werden auf Bruker AnchorChipTM 400/384er Targets zusammen mit der Matrix alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA) aufgetragen.
12 'real life' HCCA Target-Präparationen (links) und unbenutzter Anchor (rechts). Bruker AnchorChipTM 400/384er Target. PCE-MM200 Digital USB Microscope.
(Mit freundlicher Genehmigung der WITA GmbH, Teltow, Germany)
Nachweis-Empfindlichkeit
Die Nachweis-Empfindlichkeit der Methodik wurde mit einer äquimolaren Mischung fünf synthetischer Peptide mit pI-Werten zwischen pI=4.4 und pI=12.3 und monoisotopischen Massen im Peptide-Mass-Fingerprint-Bereich untersucht. Die Annotation der gefundenen Signale erfolgte mit Bruker Flexanalysis 2.0 Software unter Verwendung des SNAP-Algorithmus.
MALDI-MS Spektren der 5 synthetischen Peptide. 2nmol Peptid, HCCA-Matrix, Bruker AnchorChipTM 400/384er Target.
MALDI-MS Spektren einer äquimolaren Mischung aus 5 synthetischen Peptiden im unteren Femto-Mol bis oberen Atto-Mol-Bereich. HCCA-Matrix, Bruker AnchorChipTM 400/384er Target.
(Mit freundlicher Genehmigung der WITA GmbH, Teltow, Germany)
Die Ergebnisse zeigen, dass unter Proteinidentifizierungsbedingungen alle Peptide im unteren Femto-Mol bis oberen Atto-Mol-Bereich nachgewiesen werden können.
Datenbanksuche
Bedingt durch die hohe Nachweisempfindlichkeit der Methodik werden häufig zwei oder mehr Proteine aus 2D-Gelproben und insbesondere aus 1D-Gelbanden identifiziert. Eine hochauflösende Trennmethodik ist daher zur Probenvorbereitung von komplexen Proteingemischen insbesondere bei Zell- und Gewebenextrakten unbedingt erforderlich.
Mascot-Proteinidentifizierung (Positivkontrolle) einer 2D-Gelprobe erhalten aus Sigma A5503 "Albumin chicken egg", grade V, purity >98%.
(Mit freundlicher Genehmigung der WITA GmbH, Teltow, Germany)
Die Databanksuche erfolgt routinemäßig in einer lokalen Kopie der NCBInr-Datenbank. Projektspezifische Datenbanken im FASTA-Format können auf Wunsch eingebunden werden.
SYPRO® ist ein eingetragenes Warenzeichen der Molecular Probes Inc., Eugene (USA)
AnchorChipTM ist ein Warenzeichen der Bruker Daltonics, Bremen (Deutschland)
