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Datenanalyse

2D-Gel Probennahme


Ausschnitt eines SYPRO®-Ruby gefärbten hochauflösenden 2D-NEPHGE-Großgels - Probe: Synechocystis sp. 6803 Thylakoide.
Die Probe, eine subzelluläre Membran, zeigt insgesamt mehr als 1000 verschieden Proteinformen. Etwa 100 funktionell verschiedene Genexpressionsprodukte sind derzeit in Thylakoidmembranen bekannt. Die mit Kommentar-Flags annotierten Spots wurden für die Proteinidentifizierung ausgewählt.
(Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Irrgang, Max-Volmer-Institut, Technische Universität Berlin)


Je nach dem zu bearbeitenden Projektdesign - differentielle Proteinexpressionsstudie oder Proteininventarstudie, kann die Probennahme für sich genommen bereits zur logistischen Aufgabe werden. Während Studien zur differentiellen Expressionsanalyse selten mehr als 100 Spots zur Identifizierung auswählen, kann die Untersuchung des gesamten auf einem 2D-NEPHGE-Großgel aufgetrennten Proteininventars einer Probe leicht die Bearbeitung von 5000 oder mehr Spots erfordern.

Abhängig von der Art des Spotpickers und der physikalischen Parameter des Gels kann die Probennahme aus 2D-Gelen mit 95-99% Zuverlässigkeit erfolgen. Einige Spots werden im Gel verbleiben, einige gehen auf dem Weg verloren, den das Spotpicker-Kopf zwischen dem Gel und der Spotsammelstelle zurücklegt. Auch wenn auf Glasplatten immobilisierte 2D-Gele verwendet werden können lokale Fehler bei der Geladhäsion den Verlust größerer Bereiche des Gels und somit den Verlust noch nicht gepickter Spots verursachen. Diese kleinen fehlerhaften Stellen müssen zu Beginn der Probennahme nicht unbedingt sichtbar sein, können aber dennoch zur Verringerung der Erfolgsrate des Probennahme-Vorganges beitragen.

Folglich erfordert ein Projekt das darauf abzielt allen 5000 oder mehr Spots eines 2D-Gels eine gute Chance auf Identifizierung zu geben, eigentlich 20000 oder mehr Proben (entsprechend 3-4 immoblisierte Gele) zu nehmen um zu gewährleisten, dass jeder Spot mindestens zweimal gepickt worden ist. Dies ist jedoch in der Regel erforderlich um ausreichend Material für die nachfolgende Proteinidentifizierung bereitstellen zu können.

SYPRO® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Molecular Probes Inc., Eugene (USA)